用于 禽 病 诊 断 的 分 子 生 物 学 方 法 主 要 有 聚 合 酶 链 式 反 应
(Polymerase Chain Reaction, PCR)、 核 酸 探 针 技 术 (NucleicProbe)、序列分析(Sequencing)、限制性内切酶片段长度多态性
分析(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP)等。
(1)聚合酶链式反应 PCR 体外基因扩增方法是根据体内
DNA 复制的基本原理而建立的,首先针对待扩增的目的基因区的
两侧序列,设计并经化学合成一对引物,长度为16~30个碱基,在
引物的5'端可以添加与模板序列不相互补的序列,如限制性内切
酶识别位点或启动子序列,以便 PCR 产物进一步克隆或表达之
用。
自从 PCR 技术发明以来,已经在生命科学领域得到了广泛应
用,在人类医学上,基因诊断已经十分普遍,在禽病上目前也先后
报道了许多病毒和细菌的 PCR 检测方法,包括沙门氏菌、大肠杆
菌、禽流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性支气管
炎病毒、传染性喉气管炎病毒、马立克氏病病毒、鸡毒支原体、产蛋
下降综合征病毒。
PCR 技术不仅具有简便、快速、敏感和特异的优点,而且结果
分析简单,对样品要求不高,无论新鲜组织或陈旧组织、细胞或体
液、粗提或纯化 RAN 和 DNA 均可,因而非常适合于感染性疾病
的监测和诊断。 近年来 PCR 又和其他方法组合成了许多新的方
法,例如用于ILT 诊断的着色 PCR(Coluric-PCR),抗 原 捕 获
PCR(AC-PCR)等,进一步提高了 PCR 的简便性、敏感性和特异
性,随着愈来愈多的目的基因序列的明了,PCR 应用范围必将更
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第二章 鸡病诊断技术加广泛。 相信不久的将来,用于家禽疾病诊断的 PCR 试剂盒将在
禽病实验室诊断中得到广泛应用。
(2)核酸探针 已被广泛应用于筛选重组克隆,检测感染性疾
病的致病因子和诊断遗传疾病,其基本原理即为核酸分子杂交,双
链核酸分子在溶液中若经高温或高 pH 值处理时,即变性解开为
两条互补的单链。 当逐步使溶液的温度或 pH 值恢复正常时,两
条碱基互补的单链便会变性,形成双链,所以核酸探针是按核酸碱
基互补的原则建立起来的。 因此,核酸杂交的方式可在 DNA 与
DNA,DNA 与 RNA 以及 RNA 与 RNA 之间发生。 当标记一条
链时,便可通过核酸分子杂交方法检测待查样品中有无与标记的
核酸分子同源或部分同源的碱基序列,或“钩出”同源核酸序列。
这种被标记的核酸分子称之为探针(Probe)。
自该方法建立以来,已利用其对许多禽类病毒和细菌进行了
检测。 与常规检测方法相比,探针具有高度的敏感性、特异性及可
重复性,因而容易在禽病诊断室推广。 随着时间的推移,探针必将
为推动禽病诊断水平再上新台阶发挥重大作用。
(3)序列分析 即对禽病诊断实验室分离的野毒,进行随机克
隆,然后用Sanger的双脱氧法对其进行序列测定,接着将序列分
析结果输入电脑,与 Genebank中已经发现的禽病基因序列进行
比较,从而做出判断。
随着现代分子生物技术的发展,用序列分析对禽病做出诊断
已经不是一件太遥远的事情了,由于商品化的克隆及测序试剂盒
很多,在禽业发达国家,如果一旦分离到了病毒,则在一天之内就
能完成病毒基因组的克隆及测序工作。 而且由于这些方法都可以
自动进行,因而给工作人员带来了许多便捷。 序列分析可以说是
最准确的诊断方法,但目前我国由于实验条件和经费等问题,在普
通禽病诊断室推广该技术尚不够条件,但是在不久的将来,相信将
逐渐得到普及。
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鸡场流行病防控技术问答目前国内很多实验室里用分子生物学技术建立了多种禽病的
PCR、核酸探针等快速灵敏的禽病分子生物学诊断检测方法,有些
已达到国际先进水平,有些已经形成商品化的诊断试剂。 例如利
用 RT?PCR 方法诊断禽流感病毒的商品诊断试剂盒,已经广泛地
应用到禽流感的诊断中。
