孢子分离法也称为孢子弹射分离法, 是利用某些药用真菌子实
体成熟后自行弹射孢子的特性, 在无菌条件下, 使弹射的孢子落到
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适宜培养基上, 在适宜条件下进行培养, 孢子萌发成菌丝, 从而获
得纯菌种的一种方法。
(1) 分离材料的选择与消毒 孢子分离材料, 来自于多年人
工栽培的优良品系和野生的种菇。 在同一个生长条件下, 栽培同
一种药用真菌不同的品系, 其生产效益和品质有很大差异; 而同
一个品系栽培在不同的环境条件下, 其优良性状表现也不同, 就
是在相同环境条件下栽培的同一个品系, 其单株之间也会出现差
异。 因此, 应选 择 长 期 栽 培 的 优 良 品 种 的 优 良 单 株 作 为 分 离 材
料。 野生的菌株, 未经过人工栽培, 不知其优良性状、 抗逆能力
和生产性能如何, 只能作为育种搜集原始材料时进行孢子分离,
经过培养品系之间对比试验, 选择优良者进行生产, 在选优去劣
的培养过 程 中, 再 在 群 体 中 选 择 优 良 个 体, 作 为 孢 子 分 离 的
材料。
理想的种菇应该是具有该品种主要典型的特征, 发育正常, 个
体健壮, 无病虫害, 成熟适度的子实体。 种菇选定后, 可将其周围
10厘米左右范围内的小菇全部摘除, 适当增加喷水量, 有的药用
真菌子实体有菌幕包着, 即可待种菇有八、 九分成熟时, 及时采摘
进行消毒。 可剪去菌柄的三分之二, 用清水洗去黏附的污物, 浸入
0.1%的升汞溶液中1~2分钟或在70%的酒精中浸几秒到1分钟,
取出后用无菌水反复冲洗数次, 用灭菌的纱布或滤纸吸干表面水分
后待用。 有些药用菌如香菇的子实体, 很小时菌幕就被拉开; 或有
的种类根本无菌幕, 菌褶裸露于空气中, 很难避免有杂菌孢子附着
在菌 褶 上, 则 应 采 摘 成 熟 的 子 实 体, 剪 去 三 分 之 二 的 菌 柄, 用
75%的酒精揩擦菌盖及菌柄表面, 并在插入孢子收集器后6~12小
时内, 种菇孢子已弹出而附在上面的杂菌孢子短时间内还未脱落时
取出子实体。 而对于胶质菌类的子实体, 只能用无菌水洗涤, 用无
菌纱布吸干表面水分后待用。
(2) 孢子的采集 种菇经消毒处理后, 即可采用以下方法收集
孢子。
孢子弹射采集法: 利用孢子自动弹射出子实层的特性, 采集孢
65名贵药用真菌栽培技术问答
子。 一般采用整株插种法、 三角瓶钩悬法和试管贴附法, 全部操作
过程都应该在无菌条件下进行。
① 整株插种法: 适于伞菌类孢子的采集。 首先应准备好孢子
采集器, 用搪瓷盘或大于钟罩的培养皿作底盘, 上面放一个小培养
皿, 皿内放一个不锈钢的支架, 用钟罩盖在小培养皿上, 将整套孢
子采集器用双层纱布或报纸包好, 经高压灭菌后备用。
在无菌条件下打开孢子采集器, 揭去钟罩, 为了防止钟罩与培
养皿接触处杂菌侵入和增加采集器内部的湿度, 在大培养皿内铺
2~3层灭菌的纱布或脱脂棉, 倒入0.1%的升汞液, 以浸湿纱布为
度, 然后放入小培养皿, 将消毒后的子实体插在支架上盖钟罩后,
根据不同分离对象, 移至 18~25℃ 条件下, 培养 6 小时至 2 天,
待小皿内弹射并沉积一层孢子后, 移入无菌室, 先用75%的酒精
或0.1%升汞擦拭钟罩外部, 打开钟罩取出子实体, 小培养皿加盖
密封, 供分离用。
② 三角瓶钩悬法: 适用于不具菌柄子实体孢子的采集, 如胶
质菌银耳、 木耳等。 在无菌条件下, 将耳片用无菌水冲洗数次后,
用无菌纱布吸干水分, 将耳片挂在金属钩上, 钩子的另一端挂在三
角瓶口上, 瓶内装有 PDA 培养基, 加棉塞, 置25℃ 温度下培养
1~2天, 当培养基表面有一层孢子粉时, 把三角瓶拿到无菌室取
出耳片和钩子, 仍塞好棉塞继续培养。
③ 贴附法: 取一块经消毒的成熟菌褶或耳片, 用灭菌的琼脂
或浆糊, 黏附在装有 PDA 培养基的试管斜面或培养皿皿盖正上
方, 加棉塞或盖皿盖后置室温下培养, 待孢子自然落下后, 在无菌
室内镊除菌褶或耳片, 或将落有孢子的培养基转移在新的试管斜面
及培养皿平板培养基上, 加塞或加盖后继续培养。
④ 孢子印采集法: 取成熟的子实体经表面消毒后, 切去菌柄,
置于灭过菌的白色或黑色蜡光纸上, 罩上通气钟罩, 在24℃ 下静
置数小时后, 轻轻移去种菇, 可见有大量孢子落在纸上。 将有孢子
印的纸在无菌条件下保存备用。
⑤ 菌褶涂抹法: 在接种室内, 将成熟的子实体表面消毒, 去
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掉菌柄, 用消毒的接菌环插入两片菌褶之间, 轻轻涂抹褶片, 将尚
未弹射的孢子沾在接种环上, 然后用划线法接种在准备好的斜面培
养基上或平板培养基上。 操作时, 要严格在无菌条件下, 动作要
准确。
⑥ 空中孢子捕捉法: 伞菌子实体成熟后, 孢子大量弹射, 在
子实体周围可见烟雾状的 “孢子云”, 将准备好的培养基平板或试
管口迎着 “孢子云” 方向, 使孢子附着在培养基表面, 随即盖上皿
盖或加棉塞即可。
(3) 孢子的分离 采集到的孢子, 一般需要经过分离选择后,
才能制作原种。 孢子的分离根据接种到培养基上的孢子数量而分单
孢分离和多孢分离两种。 有些菇类的孢子, 具有单孢结菇的能力,
可采用单孢分离纯菌种的方法; 有些种类如香菇、 木耳、 金针菇等
药用真菌的单孢菌丝, 只有经过质配后才能结菇, 多采用多孢分离
法, 多孢分离方法简单、 易操作、 没有不孕现象, 在生产上常采
用; 但不能选择优良单孢繁殖后代, 如果进行杂交育种时, 仍应进
行单孢分离。
单孢分离: 从采集到的孢子群中, 挑出单个孢子进行培养, 单
独萌发成菌丝而获得纯菌种的方法。 按分离手段可分为稀释法、 划
线法、 毛细管分离法和器械分离法。
多孢分离: 因采收孢子的方式不同, 可分为直接培养法、 斜面
划线法、 涂布分离法。
① 直接培养法: 采用孢子弹射分离法、 菌褶涂抹法及捕捉法
收集到培养基上的孢子, 直接放在25℃ 下培养; 待孢子萌发后挑
选特征典型的菌落, 转接培养即可。
② 斜面划线法: 在无菌条件下, 用接种针沾取少量收集到的
孢子, 在 PDA 斜面培养基上自下而上划线, 划线时不要太用力,
以能划破培养基表面的力度。 接种后加棉塞, 置适温下培养, 待孢
子萌发后, 挑选萌发早、 生长旺盛的菌落, 转接到新试管斜面培养
基上再行培养即可。
③ 涂布分离法: 在无菌条件下, 用接种环挑取少许收集到的
67名贵药用真菌栽培技术问答
孢子, 装入有无菌水的试管中, 充分摇匀制成孢子悬浮液, 然后用
无菌的注射器或滴管, 吸取孢子悬浮液, 注入1~2滴于斜面或平
板培养基表面, 用无菌接种环涂匀, 置适温下培养。 孢子萌发后,
挑选发育匀称、 生长快的菌落, 再移接到新试管斜面培养基上, 恒
温培养即得母种。